Gel-basierte Analytik von
intakten Proteinen

Unsere Hochleistungs-Analytik von intakten Proteinen basiert auf der zweidimensionalen Gelelektrophorese (2DE). Die Proteine werden in zwei Dimensionen aufgetrennt, erstens nach dem isoelektrischen Punkt (pI) und zweitens nach ihrem Molekulargewicht. Dies resultiert in einer äußerst hohen Trennungskapazität von bis zu 2000 Proteinen in komplexen Proteomen. Im Gegensatz zu MS-basierten Analysen bleiben die Proteine während der 2DE-Analyse intakt und werden nicht zu Peptiden verdaut. Somit tragen die Proteine in der 2DE noch alle Informationen wie:

• • Post-translationale Modifikationen wie Phosphorylierungen, Glykosylierungen,

  Oxidationen

• • Protein-Isoformen
• • Protein Splicing-Varianten
• • pI-Wert
• • Molekulargewicht

Wir nutzen dabei unsere eigenen Fluoreszenz-Labeling-Technologien und kombinieren dieses mit über 10 Jahren hands-on Erfahrung. Damit können wir Ihnen einen 2DE-Service anbieten, der in punkto Leistungsfähigkeit, Genauigkeit und schneller Verfügbarkeit der Daten weltweit seines Gleichen sucht.
Je nach individueller Fragestellung und Beschaffenheit Ihrer Proben (z.B. Probenmenge, Konzentration, Pufferzusammensetzung) haben wir ein großes Portfolio an Technologien zur Auswahl.

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2DE Anwendungen und die Analyse von intakten Proteinen (Auswahl)

• • Charakterisierung eines Proteoms (Protein-Muster, PTM- und Proteinisoform-

  Verteilung): T-Rex 2D

• • Proteom-Profiling (differentieller Vergleich mehrerer Proteome): Refraction-2D,

  Saturn-2D

• • Redox-Status-Analysen: Saturn-2D REDOX
• • Untersuchungen von post-translationalen Modifikationen (Phosphorylierungen

  und Glykosylierungen): T-Rex 2D-PHOS und T-Rex 2D-GLYCO

• • 2D Western Blot Analysen: T-Rex 2D WB
• • Host cell protein analysis: T-Rex 2D HCP

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Refraction-2D (DIGE)

Weltweit bekannt als 2D Differential Gel Electrophoresis (2D DIGE) basiert unsere Refraction-2D Technologie auf der Markierung der Proteinproben mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen (z.B. G-Dye200 + G-Dye300) und der Verwendung eines internen Standards, der eine Mischung aus allen Proteinproben enthält (G-Dye100).
Zwei markierte Proben und ein interner Standard können gleichzeitig in einem Gel aufgetrennt und analysiert werden. Durch den internen Standard können mehrere Gele miteinander in Beziehung gesetzt und somit direkt verglichen werden. Dies ermöglicht eine sehr genaue Quantifizierung und Identifikation von differentiell exprimierten oder modifizierten Proteinen.

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Saturn-2D

Wenn Sie nur sehr wenig Material zu Verfügung haben, dann ist oftmals die Saturn-2D Technologie die Methode der Wahl. Sie benötigt, anders als Refraction-2D, nur ein Zehntel der Probenmenge. Aber auch wenn Ihre Proben z.B. stark salzhaltig sind und eine Umpufferung zu viel an Substanzverlust bedeuten würde, kommt Saturn-2D ins Spiel.

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Saturn-2D REDOX

Unsere Saturn-2D REDOX Technologie wurde speziell für die Visualisierung der komplexen Antwort im Proteom von Zellen auf Stress entwickelt. Mit Saturn-2D™ REDOX werden Probenspezies mit unterschiedlichem Redox-Potential spezifisch markiert und nachfolgend miteinander verglichen.

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T-Rex 2D-Phos/ 2D-Glyc/ 2D-WB/ HCP

Phosphorylierungssanalytik
In Kombination mit einer phosphorylierungsspezifischen Färbung ist der T-Rex die ideale Möglichkeit das Gesamtprotein zu markieren und als interner Standard so eine differentielle Analytik zu ermöglichen. Somit können gesamte Proteine direkt mit den phosphorylierten Proteinen verglichen werden. Im Gegensatz zu Dopplefärbungen (zuerst Gesamtprotein, anschließend Phosphoprotein) wird beim T-REX-Ansatz das Gel geschont und unspezifische Auswaschungen von interessanten Proteinen verhindert.

Glykolysierungsanalytik
In Kombination mit einer glykolysierungsspezifischen Färbung ist der T-Rex die ideale Möglichkeit, das Gesamtprotein zu markieren und als interner Standard so eine differentielle Analytik zu ermöglichen. Somit können gesamte Proteine direkt mit den glykosylierten Proteinen vergleichen werden. Im Gegensatz zu Dopplefärbungen (zuerst Gesamtprotein, anschließend Phosphoprotein) wird beim T-REX-Ansatz das Gel geschont und unspezifische Auswaschungen von interessanten Proteinen verhindert.

2D Western Blotting
T-Rex markierte Proteine lassen sich hervorragend von einem Gel auf eine Blottingmembran (0.22 oder 0.45 µm, NC oder PVDF) transferieren. Damit ist das Protein durch Fluoreszenz-Imaging zu jedem Zeitpunkt des Western Blots detektierbar (z.B. nach Transfer, nach Target-Defektion). Für Western Blots kann der Nachweis des Targets dann mittels Chemilumineszenz, Immuno Blue Fluorescent Substrate oder mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern erfolgen. T-Rex beeinflusst die Bindung durch Antikörper nicht.

Host Cell Protein (HCP) Analytik
Für die sichere Unterscheidung von wirtseigenen (host cell) und im Wirt rekombinant hergestellten Proteinen ist der 2D Western Blot der Goldstandard. Dabei eignet sich die Markierung des Gesamtproteins mit dem rot-fluoreszierenden T-Rex ideal, um dies nach Transfer auf der Blottingmembran in höchster Sensitivität und binnen Sekunden nachzuweisen. In Kombination mit einem Anti-HCP Antikörper (Fluoreszenz-markiert oder HRP-markiert + ECL) kann dann in einem einfachen, schnellen Overlay die HCP Kontamination sicher bestimmt werden. Diese Methode eignet sich ebenfalls zur optimalen Auswahl des geeigneten anti-HCP Antikörpers.

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