Western Blotting

Western Blotting

 

Octoplus QPLEX

4-Farben Fluoreszenz und Chemilumineszenz Imager

Wenn Sie ein robustes Gerät suchen, dass deutlich größere Objekte als Postkartenformat aufnehmen kann  (nämlich 20 x 25 cm) und eine knackige Fluoreszenz von blau (ca. 500nm), grün (ca. 550nm), rot (ca. 650nm) bis Infrarot (ca. 770nm) sowie sensitive Chemilumineszenz-Detektion bietet, dann sollten Sie sich den Octoplus QPLEX ansehen.

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Smart Protein Layers

Kit zur Visualisierung des Gesamtproteins 

Smart Protein Layers (SPL) ist eine (patent-pending) standard-basierte Technologie für die färbungsfreie, quantitative Analyse von Protein 1D-Gelen und Western Blots. SPL kombiniert dabei den schnellen und hochsensitiven Proteinnachweis mit einer neuen Qualität in punkto Normalisierung, Standardisierung und Quantifizierung.

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Fluoreszente Antikörper

Detektion von Targetproteinen

Wenn Ihr im Blot nachzuweisendes Protein nicht knapp über dem Rauschen liegt (dann geht wirklich nur Chemilumineszenz), sollten fluoreszierende Antikörper die Nachweismethode der Wahl sein. Rote und infrarote Secondaries bieten grundsätzlich dabei die höchste Sensitivität (da das beste Signal-zu-Rausch-Verhalten).

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Immuno Blue HRP-Substrat

Detektion des Targets 

 

Das Immuno Blue Fluorescence Substrate vereint die hohe Sensitivität der Chemilumineszenz mit der Signalstabilität und der kurzen Detektionszeit von fluoreszierenden Antikörpern.  Da wandeln HRP-konjugierte Antikörper das Immuno Blue Substrate in ein über Monate stabil fluoreszierendes Präzipitat um.

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Blotter

Protein Transfer 

Unsere Blotterserie, der BEO Dry Blotter und der VELUM Dry Blotter, wurden für den Proteintransfer aus Foliengelen (z.B. EXCEL oder VELUM Gelen) entwickelt. Ihre einfache Bedienung ohne Puffer sowie die  hohe Qualität der Blots (z.B. keine Luftblasen) machen diese einfachen Blotter aber auch zum beliebten Werkzeug für jede Art von Gel (Protein/ DNA / RNA).

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SPL LabImage 1D Software

schnelle und präzise Auswertung von qWB Analysen

Um vertrauenswürdige quantitative Western Blots durchführen zu können, bedarf es der Normalisierung des detektierbaren Targets im Verhältnis zum Gesamtprotein auf dem Blot (natürlich zu diesem Zeitpunkt, da Proteine ja nicht kovalent an der Membran gebunden sind). Die SPL LabImage 1D Software berechnet mit einem Klick die Verhältnisse von Target und korrespondierendem Gesamtprotein pro Spur und über alle Spuren (Proben).

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Western Blot Analysis

Western blots are commonly used to detect specific protein expression in a sample such as cell extracts, tissue homogenates or liquids.

The extracted total protein of a sample (e.g. cell A and cell B see figure) is separated by gel electrophoresis, transfered (blotted) onto a special membrane and the protein of interest (target) is immunodetected by specific antibodies.

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The Western Blot Workflow

The protein is extracted from a sample under denaturing conditions. (Usually) equal amounts of protein of the samples are separated by gel electrophoresis according to the molecular protein size (molecular weight). After the separation, the proteins are transferred to a specific membrane by electro- or capillary blotting.  The transferred protein is kept on the membrane surface due to hydrophobic and electrostatic interactions (nitrocellulose membranes) and hydrophobic interactions (PVDF membranes). As the interaction of the proteins with the membranes surface is in a non-covalent manner, approximately 30-90 % of the proteins  are washed down during the repeated washing and antibody incubation steps.

The protein of interest (target) is then immunodetected by a specific antibody. After several washing steps (to remove unbound antibody) approximately 40 second antibodies bind to the Fc region of the first antibody.

In order to detect the secondary antibodies, these proteins are either conjugated...

a) ... with a horse-radish peroxidase which converts a specific substrate under light emission (chemiluminescence, peak wavelength approx. 465 nm)

b) ... with a fluorophore which emits a specific fluorescence light upon adequate excitation.

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Graphic of a Western Blot analysis workflow

Loss of protein during Western Blot Analysis

Western Blot protein transfer and subsequent immunochemistry (e.g. washing steps with TBST) lead to inconsistent loss of total protein.
The ability and strength of binding of a protein to the membrane is given by its hydrophobicity (PVDF membranes) or charge + hydrophobicity (nitrocellulose membranes). In addition, abrasion of protein occurs also by mechanical forces (e.g. table shaker).

Typical losses of proteins are between 10% to 80%. This effect can be sensitively monitored only by pre-labeling the total protein with fluorophores.
Figures below show sample protein (E. coli, 20 µg per lane) visualized by using Smart Labels during Western Blot analysis. The membrane imaging was performed using an Octoplus QPLEX imager.

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